UNIMICRO通微HPLC-UV柱前衍生法测定17种氨基酸

游离氨基酸测定方法主要有柱前衍生反相色谱法、柱后衍生离子交换色谱法、离子色谱-积分脉冲安培检测法、液相色谱-蒸发光检测法、液相色谱-质谱法等，其中柱前衍生反相色谱法和柱后衍生离子交换色谱法为氨基酸测定常用方法。因柱后衍生离子交换色谱法大多需要氨基酸分析仪进行检测，仪器购置成本较高，所以，大多数情况下，可选择柱前手动离线衍生后，再采用液相色谱-紫外检测法进行分离检测。

采用通微EasySep®系列液相色谱系统，配合通微UNISIL AA(4.6 mm×250 mm, 5 μm)氨基酸分析柱，采用柱前PITC衍生氨基酸法实现了17种氨基酸的分离检测。

仪器设备

仪器：	通微EasySep®系列液相色谱系统，配备UV检测器
色谱柱：	UNISIL AA(4.6 mm×250 mm, 5 μm)氨基酸分析柱

测试结果

1）衍生反应原理：氨基酸与异硫氰酸苯酯（PITC）反应，生成有紫外吸收的苯氨基硫甲酰氨基酸衍生物（PTC-氨基酸），PTC-氨基酸经反相液相色谱分离后用紫外检测器检测。

2）衍生化反应步骤：精密量取氨基酸试样溶液200µl，置离心管中，精密加入1mol/L三乙胺乙腈溶液100µl，混匀，精密加入0.1mol/L异硫氰酸苯酯乙腈溶液100µl，混匀，密封，放置1小时，加正己烷0.8ml，充分振摇20～30秒，静置分层，精密量取下层溶液2µl，注入液相色谱系统分析。

色谱图举例

17种氨基酸分离检测色谱图

1.天门冬氨酸 2.谷氨酸. 3.丝氨酸. 4.甘氨酸. 5.组氨酸. 6. 精氨酸. 7.苏氨酸. 8.丙氨酸. 9.脯氨酸. 10.酪氨酸. 11.缬氨酸. 12.甲硫氨酸. 13. 异亮氨酸. 14.亮氨酸. 15.苯丙氨酸. 16. 色氨酸. 17.赖氨酸.

3）注意事项：因胱氨酸或半胱氨酸PITC衍生产物不稳定，所以胱氨酸或半胱氨酸无法定量；因色氨酸与鸟氨酸的PITC衍生产物分离困难，所以不适合同时含有色氨酸和鸟氨酸样品的含量测定。

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